赵维欣
黑龙江农垦职业学院 哈尔滨 150025
摘要:氨基酸是构成蛋白质的基本成分，同时也是人体重要的代谢产物，它们在调控基因表达、代谢支持及作为能源供能等环节中发挥着重要的作用，目前生物体内已经发现的氨基酸约180多种，参与蛋白质合成的仅20种，其余大多数不参与蛋白质合成，这些不参与蛋白质合成的氨基酸在疾病发生发展过程中也扮演重要角色，同时血氨基酸分析在各疾病的诊断中均已取得了相应的进展。
关键词:血氨基酸；疾病诊断；氨基酸组学
一、 血氨基酸分析理论的研究背景
（一）血氨基酸理论的提出
血氨基酸组学分析为代谢组学的分支，代谢组学是“后基因组学”时代的一个新兴学科，它与基因组学、转录组学和蛋白质组学一起构成系统生物学的核心，也是世界上最活跃的生命科学研究领域之一。代谢组学研究的对象是内源小分子，其相对分子质量小于1000。代谢组学具有以下优点：（1）基因和蛋白质中所能表达的微小变化将被代谢产物反映和扩大。（2）代谢组学研究不需要全基因组测序和大量的基因组测序，（3）所需代谢物远远少于基因和蛋白质的数量。（4）通过分析生物体液中的代谢物可以检测人体的生理或病理状态。（5）由于不同生物体中检测到的代谢物相似，代谢组学技术的应用更为普遍。代谢组学中，围绕氨基酸进行检测分析的一门分支学科，可称为氨基酸代谢组学分析。氨基酸分析技术始于20世纪50年代Spackman等[1，2]提出的定量氨基酸分析法，该方法基于离子—交换色谱，使用茚三酮进行柱后衍生并进行氨基酸的检测，随后出现的高效液相色谱法[3]，使氨基酸衍生物的快速分离分析成为可能。随着分析技术的发展，氨基酸分析可利用单纯色谱法、质谱法、毛细管电泳法以及气相色谱-质谱（Gas Chromatography- Mass Spectrome- try、GC- MS）[4]液相色谱-质谱（Liquid Chrom- atogra-phy- Mass Spectrometr，LC- MS）等联用技术[5]和核磁共振谱分析等加以完成。
（二）血氨基酸理论的研究方法
近年来，许多创新方法已经揭开了分子组学的挑战，加速了生物学数据的获取。MS可测定自然寡糖，并可通过提高分辨率功率提供详细的结构数据，例如傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）、氢氘交换质谱（HDX MS）和离子淌度分离（IMS）。为了丰富不同异构体和构象异构体的数量和丰度的信息，经常将液相色谱（LC）和IMS的分离方法
与MS相关联。电喷雾离子化ESI尤其适用于LC-MS方法，根据Hu和Mechref的说法，所形成的系统可能比MALDI-MS和LC-MALDI-MS在检测血清中的标记物时具有更高的灵敏度。 Isailovic等人通过分析该方法来描述疾病状态，将IMS-MS和三维IMS-IMS-MS技术相结合，旨在描述基于新构象而不是离子片段的结构变化。对这些IMS分布的统计分析表明，异构体分布的偏差可能表示某些疾病状态。
二、血氨基酸分析在疾病中应用已取得的成果
氨基酸分析技术在疾病研究中的应用主要是在传统标志物的基础上，发现新的疾病标志物，并对各种疾病的严重程度作出准确客观的区分，同时可以在鉴别诊断以及致病机理探索等方面对相应的临床工作起到指导性作用。血浆作为人类代谢产物的载体，无时无刻不在人体内流动，氨基酸往往可以作为人体各个时间点身体状态的投影，故人类许多疾病如各类肿瘤疾病、神经系统疾病、心脑血管疾病、代谢系统疾病和感染性疾病等均已从血氨基酸分析的角度展开了深入研究，并相继取得了可喜进展。随着人们对氨基酸作用的认识及研究的深入，血氨基酸分析已逐步应用到人类疾病的诊断之中[6]。
（一）在神经系统疾病中的应用
阿尔茨海默病（AD），为一种慢性不可逆的神经退行性变，其主要影响人群为65岁以上的老年人群，发病率约为百万分之44，神经递质（NTs）可能在神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）中起重要作用。为了研究潜在的联系，基于原位超声辅助衍生分散液-液微萃取（原位UA-DDLLME）和超高效液相色谱串联质谱技术，建立了一种简单、快速、准确、灵敏的分析方法——光谱测定法（UHPLC-MS / MS）。已有研究表明，AD患者的神经递质含量及其在血液中的代谢产物与正常人是不同的[7,8]。Zhao等[9]通过原位超声辅助衍生分散液-液微萃取（原位UA-DDLLME）技术联合超高液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS / MS），应用于AD大鼠尿液分析。研究发现AD大鼠二羟苯基乙二醇（DHPG）和甲氧基苯基乙二醇（MHPG）的尿含量为明显升高。γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸(Gly)也高于对照组，而左旋多巴(L-DOPA)、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、去甲变肾上腺素(NME)、3-甲氧基酪胺盐酸盐（3-MT）、二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）、腺苷脱氨酶（ADA）、二羟扁桃酸（DOMA）、香草扁桃酸（VMA）、五羟色胺（5-HT）和天冬氨酸（Asp）显著降低。并表明了基于原位UA-DDLLME后进行的UHPLC-MS / MS（MRM）分析，已成功应用于同时测定AD模型大鼠尿液中的AANTs和MANTs。这种原位UA-DDLLME方法灵敏、准确、快速、简单、无环境污染且成本低廉，并可在16分钟分离时间内测定22种分析物。该方法可作为某些疾病的生化指标和药物治疗监测的临床应用。
（二）在呼吸系统疾病中的应用
李志刚等[10]通过HPLC-MS/MS法对40例慢性阻塞性肺病（COPD）稳定期肺气虚证患者血浆氨基酸分析的研究中证实：同型半胱氨酸、鹅肌肽、肌肽在肺气虚证组治疗前升高，肺气虚证组治疗后和健康对照组未检出。该研究表明血浆氨基酸分析可用于肺气虚证患者的诊断。2014年Joseloff等[11]通过收集31例囊性纤维化（CF）儿童血清标本及31例非囊性纤维化患儿血清标本进行气相色谱和液相色谱代谢组学分析，使用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和线性建模比较代谢物的相对浓度，得出结论：CF和非CF之间检测到的代谢物不同，通过血清代谢组学可鉴别CF与非CF，并显示CF中细胞能量代谢发生改变。并可反映潜在的线粒体功能障碍。
（三）在内分泌代谢性疾病中的应用
妊娠期糖尿病（GDM）是一种未经诊断糖尿病的孕妇在不同程度表现葡萄糖耐受不良的病症，特别是妊娠晚期。流行病学表明，妊娠期糖尿病的发病人数正在全球范围内增加，GDM的发病率估计在1％到14％之间。现有研究已经证实，氨基酸的代谢组学分析可用于代谢疾病的早期诊断。Rahimi等[12]完成一项针对83例18-40岁孕妇妊娠期糖尿病的发生与血浆氨基酸关系的研究，探讨氨基酸分布与GDM的关联，该研究表明：与正常母亲相比，妊娠期糖尿病（GDM）母亲血浆中部分氨基酸明显升高，其中包含精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。该项研究证实了氨基酸种类及水平的变化与GDM发病风险存在明显的相关性，在此基础上，该研究者认为，氨基酸组用于GDM的研究可进行延展，并进行进一步的前瞻性研究，旨在阐明不同代谢物在GDM机制中的作用。考虑到世界上糖尿病日益流行，通过代谢组学研究等方法来预测和早期诊断GDM将成为可能。
（四）在肝脏疾病中的应用
肝脏疾病是世界范围内的公共卫生问题。针对多种肝病，如病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、酒精肝及肝细胞癌等的临床诊断指标缺乏明显的特异性，该类疾病的诊断主要包括相关疾病的病史和各项相关评分，因此，诊断上具有较高的主观性、不准确性和一定的局限性。随着近年来氨基酸组学在该项领域中的发展，该方法已经成功应用于肝脏疾病的研究，成为当前医学界的一个研究热点。通过该氨基酸组学方法，在肝脏疾病发生时，可敏感、特异地发现血浆代谢产物中的生物标志物。例如，针对药物对肝脏毒性的研究，Clayton[13]等用核磁共振质谱技术（NMR）代谢组学研究对乙酰氨基酚在尿液中的次级代谢。研究发现对甲酚和对乙酰氨基酚竞争硫酸化的机制，更高的对甲酚水平会导致硫酸化对乙酰氨基酚水平降低并增加其毒性。Godoy[14]等研究基于尿核磁共振谱的代谢组学来区分丙型病毒性肝炎（HCV）感染患者，并具有高敏感度（94％）、特异性（97％）和准确性（95％）。这些发现揭示了代谢组学可以使用尿液样本，对HCV相关肝炎进行诊断，同时具有成本低、无创等优点。肝癌是中国病毒性肝炎患者预后最差的转归之一。慢性病毒性肝炎，特别是慢性乙型病毒性肝炎患者通常会经历肝炎—肝硬化—肝癌三个病理阶段。而在有效地预防肝癌的发生中，及早诊断是最为有效的策略。通过大批量样本的队列研究，Luo[15]等人发现，苯丙氨酰色氨酸和甘氨胆酸在慢性肝炎演进过程中会出现规律性变化。其组合用于早期发现肝癌病变的价值比现用的甲胎蛋白（AFP）等传统标志物指标优越很多，而且能有效排除肝炎和肝硬化部分患者出现的非特异性AFP升高对肝癌诊断的影响。同时，基于代谢组学研究发现，包括葡萄糖代谢，特别是柠檬酸循环、脂质代谢、氨基酸代谢、尿素循环、胆汁酸代谢、胆红素代谢、糖原异生、炎症、免疫反应、细胞再生和细胞凋亡等因素在肝脏疾病中相互作用，一起促进肝脏疾病的发展。
（五）在肿瘤性疾病中的应用
曾有国外学者研究表明血浆游离氨基酸（PFAAs）的再分配是癌症患者蛋白质代谢异常的基本特征[16,17]。Zhao等通过自动氨基酸分析仪对28例原发性肺癌患者血浆游离氨基酸（plasma free amino acids， ,PFAAs)）及组织游离氨基酸（tissue free amino acids ，TFAAs)）的分析中发现，肺癌患者PFAAs显著降低（p <0.01），同时色氨酸、鸟氨酸等相比对照组降低，而苯丙氨酸增高（p <0.05），相比较TFAAs，血浆PFAAs变化曲线更为显著[18]。通过术后针对肿瘤组织的分析得出在肺癌组织内，谷氨酸、丝氨酸和缬氨酸均相比于肺旁组织的分泌量明显增加，表明了葡萄糖的异生不仅在肝脏或肾脏合成，也在癌组织合成[16,17]，这给了我们提示了一个新的思路，基于血氨基酸分析研究的基础上测定PFAAs变化曲线，有利于早期发现肺癌患者。
国内有学者研究表明，卵巢癌患者血浆粘附分子含量升高，主要为可溶性细胞黏附因子1（sICAM-1）、可溶性血管细胞黏附分子1（sVCAM-1）及选色素E（E-selec-tic），同时氨基酸，如半胱氨酸、组氨酸及亮氨酸含量降低，该实验证实了血氨基酸变化与卵巢癌存在明显相关性，该实验研究成果的得出，对卵巢癌的早期诊断及引导后期治疗方案的选择具有一定价值[18]。
血氨基酸分析同样在对结肠癌的分析中取得了一定成果，Gao等基于毛细管电泳-质谱联用法（CE–MS）分析结直肠癌（CRC）组织及癌旁组织样本，可检测出203种代谢产物，其中152种代谢产物在CRC及癌旁组织中存在显著差异，缩小了恶性肿瘤相关代谢物变化的范围[19]，该结果表明，甲硫氨酸、酪氨酸、缬氨酸和异亮氨酸可以用于区分CRC与晚期腺瘤。该项研究在临床病理实践中揭示了氨基酸分析在疾病诊断，尤其是恶性肿瘤诊断中的重要价值。
综上所述，氨基酸组学在目前已经开展的各项研究中，已经有了相当的进展。但作为一种新技术，它也面临着方法论和实际应用方面的挑战。首先，从方法论角度看，目前的数据分析过于强烈地依赖于相关技术，现有的分析工具和技术或数据处理方法都需要进一步开发。从应用的角度来看，许多疾病相关的代谢组学研究只能认识到不同代谢产物，而这些代谢物并未被用作诊断疾病的敏感和特异性标记物。氨基酸组学虽然存在上述缺陷，处于发展阶段，但代谢组学在疾病中的应用已成为学术界的热门话题。血氨基酸分析经过数年的发展与研究，在诸多科学领域均取得长足发展。近年来，随着该项技术的发展，血氨基酸分析在医疗领域也取得了令人瞩目的成果，尤其在疾病的早期诊断、鉴别诊断中。生物体中可见的氨基酸类化合物大约有180多种，受仪器的灵敏度和分辨率所限制，许多的氨基酸，利用目前已有的检测技术尚无法准确检测。血氨基酸分析用于疾病的诊断等研究尚需进一步发展，但目前的研究表明了该项技术具有巨大的发展空间及在疾病诊断中独特的优势。相信随着该项技术的发展，越来越多的疾病的早期诊断及指导治疗成为可能。
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项目来源：本文系辽宁省自然科学基金指导计划项目（项目编号：201602206）的研究成果。
作者简介：赵维欣（1989—），辽宁本溪人，宾西校区护理学院教师，主治医师，硕士学位，主要从事高职护理专业的教学与研究。
